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Detección de la mutación V617F del gen JAK2 mediante análisis de disociación de alta resolución

Trabajo publicado en la última Edición de la Revista Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana (2014; 48 (4): 447-55), realizado en el Área Biología Molecular de Fares Taie Instituto de Análisis en colaboración con el Servicio de Hematología de la Clínica Colón.

Autores

Silvina Quintana (1a), Erika Schoenfeld (2b), Vanesa Di Gerónimo (3a), Nazarena Martín (4b), Fernando Pagani (4b)

(1) Ph D. Licenciada en Cs. Biológicas.

(2) Licenciada en Cs. Biológicas.

(3) Técnica.

(4) Médico.

(a) Laboratorio de Biología Molecular, Fares Taie Instituto de Análisis, Mar del Plata. Argentina.

(b) Servicio de Hematología. Clínica Colón. Mar del Plata, Argentina.

biologia molecular

Resumen

La Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MP) son neoplasias mieloproliferativas caracterizadas por una proliferación excesiva de una o más líneas mieloides. En el año 2005 se identificó una mutación somática en el gen Janus kinase 2 (JAK2), que resulta en el reemplazo en la proteína de una fenilalanina por una valina en la posición 617 (JAK2 V617F).

Esta mutación se encuentra en el 95% de pacientes con PV, y en la mitad de los casos de TE o MP. Se han descripto metodologías que permiten identificar esta mutación: dentro de las más utilizadas se encuentran la ARMS PCR (del inglés Amplification Refractory Mutation System PCR), la secuenciación y recientemente la HRM (High Resolution Melting). En este trabajo se estudió la detección de JAK2 V617F en muestras de pacientes con desórdenes mieloproliferativos mediante HRM, determinando especificidad y sensibilidad de la misma, comparándola con la ARMS PCR y la secuenciación.

Los resultados demostraron que la técnica de HRM es superior a la secuenciación y equivalente a la ARMS PCR. Las metodologías sensibles y específicas para la detección de JAK2 V617F, en pacientes con neoplasias mieloproliferativas, son de gran importancia a nivel diagnóstico ya que permiten diferenciar entre desórdenes neoplásicos y condiciones reactivas.

Introducción

Las neoplasias mieloproliferativas son un grupo de enfermedades caracterizadas por una excesiva producción de células sanguíneas, dentro de las cuales se encuentran la Policitemia Vera (PV), la Trombocitemia Esencial (TE), la Mielofibrosis Primaria (MP) y la Leucemia Mieloide Crónica (LMC). En estos trastornos clonales, estrechamente relacionados, las líneas sanguíneas afectadas son: eritrocitos, en el caso de PV; plaquetas, en el caso de TE, leucocitos en el caso de LMC, fibroblastos de la médula ósea en casos de MP, que ocasionan un funcionamiento anormal de las células, presentando hipersensibilidad a los factores del crecimiento. Durante 2005 se describió una mutación somática en el gen JAK2 (del inglés Janus Kinase 2), debida a la sustitución de una guanina por una timina en el nucleótido 1849 del exón 14, la cual resulta en el reemplazo de una valina por una fenilalanina en la posición 617 del dominio JH2 de la proteína, por la cual
se denomina a la mutación JAK2 V617F.

Kralovics et al han demostrado que esta mutación participa en la patogenia de las neoplasias mieloproliferativas, debido a que contribuye a la expansión clonal de estos desórdenes, especialmente por una ganancia de función del gen JAK2 y una activación constitutiva de la proteína. Según el tipo celular donde ocurra esta mutación, el desorden que genera es distinto. En el caso de que la mutación se produzca en los glóbulos rojos, el fenotipo que genera es la PV. En el caso de las plaquetas, es la TE, y si el tipo celular afectado son los neutrófilos, genera MP.

El valor diagnóstico principal de detectar la presencia de JAK2 V617F consiste en la demostración de clonalidad, permitiendo el diagnóstico diferencial entre condiciones neoplásicas respecto a las reactivas, como la poliglobulia secundaria y la trombocitosis reactiva.

La presencia de JAK2 V617F ha sido reportada en la mayoría de los pacientes con neoplasias mieloproliferativas; la misma puede ser detectada en el 95% de los casos de PV, y en la mitad de los casos de TE o MP.

También se ha descripto la detección de JAK2 V617F en algunos pacientes con LMC.
La identificación reciente de esta mutación representa un importante avance en el conocimiento de la patogenia de estas neoplasias. Se han descripto diversas metodologías que permiten identificar la mutación. Según el criterio utilizado para el diagnóstico, el tipo de muestra, la sensibilidad y especificidad técnica, existen discordancias en la tasa de incidencia de JAK2 V617F en casos de PV, TE y MP. Dentro de las técnicas más utilizadas se encuentran: ARMS PCR (del inglés Amplification Refractory Mutation System PCR), la secuenciación y la nueva técnica HRM (del inglés High Resolution Melting), considerándose la técnica de ARMS PCR como la más sensible para la detección de JAK2 V617F.

El análisis de HRM es una metodología post-PCR que permite la identificación de variaciones en la secuencia de ADN, basada en el análisis de curvas de fusión de fragmentos de ADN, amplificados mediante PCR en tiempo real. Esta técnica requiere de una PCR con excelente eficiencia, además de un software dedicado.

Las curvas de fusión son generadas a partir del monitoreo de fluorescencia emitida por un intercalante de ADN, que se encuentra en cantidad saturante y que no inhibe la reacción. Para ello, se eleva la temperatura de la muestra a través de un rango de temperaturas a medida que la fluorescencia va siendo recolectada. Cualquier cadena doble hebra presente en la muestra emitirá fuertemente fluorescencia a bajas temperaturas. Pero a medida que esta última aumenta, la fluorescencia disminuye al principio, lentamente, hasta que a una determinada temperatura, decae de manera abrupta, reflejando la temperatura de melting (Tm). La Tm depende de la secuencia, el contenido de GC y del largo de la secuencia del producto de PCR. Mediante el análisis por HRM se pueden detectar variaciones de secuencia de una sola base como los polimorfismos de única base, SNPs, (del inglés Single Nucleotide Polymorphisms) o descubrir mutaciones genéticas desconocidas. También se puede utilizar para detectar cuantitativamente una pequeña parte de ADN mutado en un background de ADN wild type (WT), con sensibilidades cercanas al 5%.

Se han descripto varias metodologías para la detección JAK2 V617F mediante análisis de curvas de melting. En el año 2009 Rapado et al describieron una metodología por análisis de curvas de melting de alta resolución para la detección de esta mutación.

Debido a la alta frecuencia con que JAK2 V617F se encuentra en la PV y en menor grado en la TE y la MP, se ha postulado que la detección de esta mutación tendría un fuerte impacto en el diagnóstico, la clasificación y el tratamiento de estas entidades. El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de una metodología de High Resolution Melting para la detección de JAK2 V617F en muestras de pacientes con neoplasias mieloproliferativas y la comparación de la metodología de HRM a nivel de especificidad y sensibilidad para detectar JAK2 V617F con las técnicas de secuenciación y ARMS PCR.

Discusión y Conclusiones

Con el advenimiento de la medicina personalizada existe una gran necesidad de métodos rápidos y precisos para la detección de mutaciones asociadas a las diferentes patologías. Una tecnología ideal debe ser lo suficientemente sensible como para detectar las mutaciones aun existiendo cantidades significativas de contaminación con células WT. En el caso particular de la detección de JAK2 V617F, una técnica de alta sensibilidad es esencial ya que ésta es una mutación adquirida, cuya carga alélica va en aumento con el avance de la enfermedad. Además debe ser robusta, rápida, simple y rentable para ser fácilmente llevada a cabo en un laboratorio de diagnóstico. La técnica de HRM es una técnica emergente para la detección de mutaciones en muestras clínicas. La HRM es un método no destructivo que permite un análisis posterior de los productos de PCR mediante electroforesis en gel o secuenciación. Provee un sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación, el tiempo de análisis y no requiere de procesamiento o separación después de la PCR.

Basado en su facilidad de uso, bajo costo, sensibilidad y especificidad, la HRM es la herramienta por excelencia para distintas aplicaciones: screening y detección de mutaciones, metilación, genotipado, búsqueda de SNPs, entre otras.

Está descripto que alrededor de un tercio de los pacientes con PV, 20 a 30% de aquellos con MP y menos del 5% con TE, son homocigotas para la mutación JAK2 V617F. En el presente estudio en todos los casos en los que se ha encontrado la presencia de JAK2 V617F fue en estado heterocigota, de modo que en ninguno de los pacientes estudiados se ha llegado a la pérdida de heterocigosidad descripta en la bibliografía.

La determinación de la sensibilidad y especificidad de las técnicas de HRM y la secuenciación se realizaron con respecto a la técnica ARMS PCR, debido a que ésta se considera la técnica gold standard para la detección de la mutación JAK2 V617F. La secuenciación, si bien permite identificar de manera precisa el tipo de mutación presente, tiene las desventajas de poseer alto costo relativo y limitada sensibilidad, lo cual se comprobó en el presente trabajo, en donde se calculó para esta técnica un 100% de especificidad pero un 94% de sensibilidad.

Este último porcentaje se debió a que no se detectó JAK2 V617F en la muestra del paciente número 13, aunque sí fue detectada con las otras dos metodologías. Esto puede deberse a que en ese paciente la cantidad de mutación presente haya sido menor al 20%, límite para la detección de mutaciones por secuenciación En el presente trabajo la metodología de HRM previamente descripta por Rapado et al mostró una sensibilidad y especificidad del 100% con respecto a la técnica de ARMS PCR, con lo cual demuestra ser una herramienta fiable para la detección de JAK2 V617F, demostrando además ser más sensible que la secuenciación.

La detección precisa de JAK2 V617F es de gran importancia a nivel diagnóstico ya que permite diferenciar entre desórdenes neoplásicos y condiciones reactivas. La técnica de HRM es una metodología sensible y específica que podría utilizarse para la detección de JAK2 V617F en pacientes con neoplasias mieloproliferativas.

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