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Detección de Herpes simple 1 y 2 por PCR en Tiempo Real e identificación por High Resolution Melting

Trabajo presentado en la XXXIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología, 2 y 3 de Diciembre de 2013

Autores

 

Estevez MS (1); Di Gerónimo V (1); Quintana S (1,2).

(1) Fares Taie Instituto de Análisis, Mar del Plata, Argentina;

(2) IAC Internacional, Mar del Plata, Argentina

Contacto: virologia@farestaie.com.ar

 

Los Herpes simple 1 y 2 (HSV1 y HSV2) son patógenos virales de distribución mundial que pertenecen a la familia Herpesviridae, subfamilia alfaherpesviridae, responsables de lesiones mucocutáneas que pueden progresar a infecciones sistémicas

El HSV1 puede generar cuadros severos y mortales como es el caso de la encefalitis herpética o de la meningitis aséptica. El HSV2 puede producir los mismos cuadros del HSV1 siendo muy severos en el recién nacido, al contraer la infección por contacto con lesiones activas en el canal de parto.

El diagnóstico de las encefalitis y meningitis virales deben ser realizadas por técnicas de detección de ADN ya que los métodos serológicos no son adecuados. Las técnicas de PCR en Tiempo Real permiten obtener resultados de alta sensibilidad y especificidad en pocas horas. La técnica de High Resolution Melting (HRM) es un nuevo método de análisis que permite caracterizar productos de PCR en base a la longitud de la secuencia, el contenido de GC y la complementariedad de secuencia de ADN. El análisis por HRM se puede utilizar para determinar genotipos y especies de diferentes virus y bacterias.

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método in house para la determinación de ambos tipos virales, utilizando PCR en Tiempo Real para la detección y la técnica de HRM para su diferenciación.

Se seleccionaron tres pares de primers genéricos para Herpes simple los cuales amplifican fragmentos de diferente tamaño a partir de ADN viral (290 pb, 146 pb, 124 pb). Una vez seleccionados y sintetizados los primers se realizó la puesta a punto de la amplificación con los controles positivos de HSV1 y HSV2. En cada caso se buscó obtener las mejores condiciones de amplificación que no produzcan falsos positivos ni falsos negativos. Se seleccionaron los primers que amplifican el fragmento de 124 pb dado que presentaron las mejores características de amplificación. Se realizaron pruebas de sensibilidad para ambos tipos de Herpes simple y de especificidad con otros virus de la familia Herpesviridae. Se calculó la eficiencia de reacción para ambos tipos de Herpes siendo de 93 % y de 94% para HSV1 y HSV2, respectivamente. Para diferenciar HSV1 de HSV2 se utilizó la técnica de HRM. HSV1 y HSV2 presentaron diferencias en las curvas de disociación evidenciadas por esta técnica, permitiendo de este modo la diferenciación entre ambos virus.

Se logró desarrollar una técnica de PCR en Tiempo Real para la detección de Herpes simple 1 y 2. La posterior aplicación de la técnica de HRM permitió diferenciar entre ambos tipos virales, logrando de este modo un método sensible y rápido para ser utilizado en la práctica clínica.

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