ISO 9001 “Gestión de la Calidad” - ISO 14001:2005 “Gestión Ambiental” - Integramos la Red Nacional de Laboratorios de SENASA con habilitación N° L 0035 - Integramos la red Provincial de laboratorios de Organismo Provincial para el Desarrollo Sostenible OPDS con habilitación N° 007 - Acreditación de ensayos en el área de Alimentos y Medio Ambiente por el OAA Organismo Argentino de Acreditación bajo Normas ISO 17025. - E.N.R.E. - Ente Regulador de Electricidad

Biología Molecular para el diagnóstico de Brucelosis bovina

Este artículo fue publicado en la Edición Nº8 de la Revista 365.Campo

Dra. Mariana Recavarren y Lic. Silvina Quintana

Laboratorio de Biología Molecular Veterinaria. Fares Taie Instituto de Análisis, Mar del Plata.

veterinaria@farestaie.com.ar 

En nuestro país, los bovinos entre los 3 y 8 meses de edad son vacunados obligatoriamente contra brucelosis con la cepa atenuada de Brucella abortus biovar 1 (cepa 19, fase lisa). Las pruebas de laboratorio utilizadas actualmente (Aglutinación en placa: BPA, Seroaglutinación en tubo: SAT y 2-ME y Polarización de la fluorescencia: FPA), detectan los anticuerpos contra B. abortus pero, los títulos serológicos en los animales vacunados son indistinguibles de los naturalmente infectados.

El desarrollo de técnicas de biología molecular juega un papel importante en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas en los humanos y ahora también en los animales, el cual está enfocado en la detección directa del ADN del agente patógeno en las muestras clínicas. Dentro de ellas y la más novedosa a nivel mundial es la técnica de PCR en Tiempo Real, la cual es una amplificación selectiva de una región elegida dentro de una molécula de ADN que se va cuantificando con marcadores fluorescentes permitiendo así la detección directa del patógeno responsable de la infección con una alta especificidad y sensibilidad, en forma rápida (3 horas) y a gran escala (100 muestras promedio).

El objetivo del presente trabajo fue poner a punto una técnica de PCR en Tiempo Real para detectar ADN de las cepas vacunal (S19) y de campo (CC) de B. abortus, a partir de cultivos puros y de muestras de suero de vaquillonas. Se realizaron las pruebas de aglutinación en placa (BPA) y tubos (SAT y 2-ME), Polarización de Fluorescencia (FPA) de sueros de vaquillonas vacunadas fuera de la época requerida y; extracción, cuantificación y amplificación de ADN de cultivos puros de B. abortus S19 y CC, y de dichos sueros por PCR en Tiempo Real. Las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando dos pares de cebadores que amplificaron fragmentos de 361 pb para S19 y de 178 pb para CC, respectivamente; utilizando EvaGreen como intercalante fluorescente. Mediante una curva de disociación de alta resolución se corroboró la amplificación del producto del peso molecular esperado y se determinó la inexistencia de amplificación inespecífica de los cebadores entre las cepas control S19 y CC. Previo a la detección de ADN de B. abortus se realizó amplificación con cebadores que detectaron ADN bovino como control interno, con el fin de chequear el éxito de la extracción de ADN y la inexistencia de inhibición en la reacciones de PCR.

Mediante esta técnica se logró amplificar ADN de B. abortus a partir de cultivos puros de las cepas S19 y CC con una sensibilidad >0,05 nanogramos de ADN. De las 14 muestras de suero de bovinos positivos a brucelosis por las técnicas serológicas, 4 resultaron positivas para CC, 4 positivas para S19 (Figura 1) y 6 positivas para ambas cepas por PCR en Tiempo Real (Tabla 1). Esto último podría estar indicando que habría coexistencia de ambas cepas en el momento del muestreo.

La PCR en Tiempo Real es una técnica de biología molecular muy útil que permitió detectar y diferenciar la S19 de la CC. Se necesitan futuros trabajos de experimentación para evaluar su utilidad en diferenciar animales vacunados de infectados.

 

dianostico por BPA
 
brucelosis
 
Figura 1: Curva de disociación de alta resolución de los productos de amplificación del ADN correspondiente a muestras clínicas por PCR en Tiempo Real. Se diferencian claramente las curvas correspondientes a S19 (Temperatura de Melting: 91,7 °C) de la curva de CC. Se representa en el eje de las ordenadas la tasa de cambio de las unidades relativas defluorescencias (URF) con el tiempo (T) (‐d (URF)/dT) versus la temperatura (º C) en el eje de las abscisas. Esta tasa se marca como un pico a la temperatura específica de disociación. 

 

brucelosis
Revista 365.Campo | Número 8 
 

 

  • Rivadavia 3343
  • Tel.Fax: 0223 410 4820 al 27 ó 475 3855
  • 7600 Mar del Plata - Argentina
  • Avellaneda 1286
  • Tel.: 0223 486 1845
  • 7600 Mar del Plata - Argentina
  • Magallanes 3019
  • Tel: 0223 489 7704
  • 7600 Mar del Plata - Argentina
  • Av. Constitución 4773
  • Tel.: 0223 471 2100
  • 7600 Mar del Plata - Argentina
  • Av. Colón 2174
  • Tel.: 02291 480248
  • Otamendi - Argentina

Laboratorios en colaboración para la resolución de muestras de Alta Complejidad, Genética Molecular y/o de Alimentos y Medio Ambiente

  • Villa Gesell Instituto de Análisis
  • Paseo 118 nº 357
  • Tel.: 02255 47 6515
  • Villa Gesell - Argentina
  • Laboratorio de Análisis Clínicos Medicomp.
  • Calle: 15 de Abril Esq. Cnel. Delgadillo. Planta Baja.
  • Tel.(591) 4 6636790
  • Fax. (591) 4 6668615
  • Cel. (591) 71860232
  • Tarija - Bolivia
  • Sistemas Genomicos
  • Parque Tecnológico de Valencia
  • Ronda G. Marconi, 6 - 46980 Paterna
  • (Valencia) España
  • BairesLab
  • Entre Rios 2043
  • Capital Federal - Argentina
©Copyright - 2004-2017 Fares Taie Instituto de Análisis Desarrollado por OSMOSIS